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人胰島素(INS)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明書

更新時間:2023-03-29   點擊次數:641次

人胰島素(INS)酶聯免疫吸附測定試劑盒使用說明書

實驗原理 

本試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 。往預先包被有人胰島素(INS) 捕獲抗體的微孔中, 依次加入樣本、標準品、生物素標記的檢測抗體,HRP 酶結合物,中間經過溫育和洗滌,用底物 TMB 顯色,TMB 在過氧化物酶(HRP)的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素  (INS) 呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度 (OD ) ,計算樣品濃度。

操作步驟 

1.  從室溫平衡 10 分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  加樣:分別將樣品或不同濃度標準品按照 100 μ l 每孔加入相應孔中,空白孔加入 100μL 通用稀釋液。蓋 上封板膜后 37℃溫育 1 小時。  (建議:將待測樣本用通用稀釋液稀釋 1 倍后再加入酶標板內測試。 減少基質效應對測試結果的誤差影響,最后計算樣本濃度時需乘以對應的稀釋倍數。所有的待測樣本和 準品在檢測中建議設立復孔) 。

3.  加生物素化抗體:取出酶標板,棄去液體,不用洗滌。每孔直接加入生物素化抗體工作液 100 μL,蓋上  37℃溫育 1 小時。

4.  洗板:棄去液體,每孔加入 300 μL 1x 洗滌液,靜置 1 分鐘,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板

3 次 (也可用洗板機洗板) 。

5.  加酶結合物工液:每孔加入酶結合物工作液 100 μL,蓋上封板膜后 37℃溫育 30 分鐘。

6.  洗板:棄去液體按步驟 4 洗滌方法,洗板 5 次。

7.  加底物:每加入底物(TMB)90 μL,蓋上封板膜,37℃避光溫育 15 分鐘。

8.  加終止液:取出酶標板,每孔直接加入終止液 50 μL,立即在 450nm 波長處測定各孔的OD 。



結果判斷:

1.  計算標品和樣本復孔的平均 OD 值并減去空白孔的OD 值作為校正值。以濃度為橫坐標,OD 值為縱坐標, 雙對數坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。

2.  若樣品OD 值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。

型數據和參考曲線:

以下據和曲線僅供參考,實驗者需根據自己的實驗建立標準曲線。

image.png

 

 

 (ng/mL)

10

5

2.5

1.25

0.625

0.312

0. 156

0

OD 

2.22

1.56

0.92

0.63

0.42

0.25

0. 18

0.08

OD 

2. 14

1.48

0.94

0.55

0.34

0. 17

0.1

 

-





盒性能 

1.  重復性:板內變異系數小于 10%,板間變異系數小于 10%。

2.  回收率:在選取的健康人血清、血漿和組織勻漿中加入 3 個不同濃度水平的人 INS,計算回收率

 

本類型

均回收率

 (n=8)

84- 101

96

漿(n=8)

92- 105

102

細胞培養上清(n=8)

96- 108

105

 

 

3.  線性稀釋:分別在選取的 4 份健康人血清、血漿和組織勻漿中加入高濃度人 INS,在標準曲線動力學范圍

進行稀釋,評估線性。評估線性。

本試劑只能用于科學研究,不得用于醫學診斷          6


 

 

稀釋比

收率  (%)

漿

  培養

1 2

 (%)

84-95

88-96

90- 110

均回收率  (%)

91

93

96

1 4

 (%)

89- 103

87- 108

105- 115

均回收率  (%)

94

98

108

注意事項

1.  嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫 20-25℃ 。使用

后立即冷藏保存試劑。

2.  洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

3.  消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD 值。

4.  底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,已經變藍的底物液不能使用。

5.  避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

6.  在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7.  平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

8.  任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑

的生物活性。

9.  不能使用過期產品。

10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。


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